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NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)微量

简要描述:测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为

  • 产品型号:PMDH-1-M
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2024-05-14
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详情介绍

测定意义:

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH, NADP-MDH主要存在于真核细胞中。


测定原理:

NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。


需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。


试剂的组成和配制:

试剂一、提取液100 mL×1瓶,在4℃保存;

试剂二、液体20 mL×1瓶,在4℃保存;

试剂三、粉剂×1瓶,-20℃保存;


样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。


测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、检测工作液的配制:用时在试剂三中加入19mL试剂二和0.5mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

3、测定前将检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本和195μL工作液,混匀后立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

注意:若A1-A2大于0.5,需将酶液用提取液稀释,使A1-A2小于0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。


NADP-MDH活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)NADP-MDH活力的计算

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 

NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=6430×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NADP-MDH活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T =6430×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=12.86×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500万。




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