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线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-辅酶Q还原酶

简要描述:测定意义:
复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使O2还原生成O2.-,是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。

  • 产品型号:FHTA-1-M
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2024-05-14
  • 访  问  量:243
详情介绍

测定意义:

复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使O2还原生成O2.-,是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。


测定原理:

复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。


试剂的组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体1.5mL×1瓶,-20℃保存;

试剂四:液体25mL×1瓶,-20℃保存;

试剂五:液体1mL×1支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入2mL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

工作液的配制:临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。


样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

①准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g,4℃离心5min。

③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅰ酶活性测定。


测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六,混匀,记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。



复合体Ⅰ活力单位的计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1)按蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅰ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅰ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=365×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.73×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。




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