微量法 100T/96S
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GCL 是 GSH 合成的限速酶,GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL 基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL 活性高低对 GSH 含量和 GSH/GSSG比值有重要影响。
测定原理:
在 ATP 和 Mg2+存在下,GCL 催化谷氨-酸和半胱氨-酸合成γ-谷氨酰半胱氨-酸;同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出 GCL 活性。
自备仪器和用品:
冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、浓硫酸和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体 105mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 6 mL 蒸馏水充分震荡溶解。
试剂三:粉剂×1 管,4℃保存。临用前加入蒸馏水 1.5 mL 充分震荡溶解。
试剂四:液体 7mL×1 瓶,室温保存。
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 12 mL 蒸馏水,充分震荡溶解后,缓缓加入 400µL浓硫酸(自备),边加边搅拌。
粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
血清等液体:直接测定。γ-谷氨酰半胱氨-酸连接酶(GCL)测试盒