微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,GP,EC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶,使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1,4-糖苷键移去葡萄糖基,释放 1-磷酸葡萄糖,直至临近糖原分子 α-1,6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(GPb)两种形式。GPb 在一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。
测定原理:
GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH,在 340nm 下测定 NADPH 上升速率,即可反映 GP 活性。添加一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)时测定 GP(GPa 和 GPb)活性,未添加腺苷酸(5,-AMP)时测定 GPa 活性,GP 活性-GPa 活性得到 GPb 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 16 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1 支, -20℃保存;糖原磷酸化酶b(GPb)测试盒