多酚氧化酶(PPO)测试盒
微量法100管/48样。
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
测定意义:
PPO(EC1.10.3.1)主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是一种含铜的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化产生醌,从而引起褐化,与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理:
PPO能够催化邻苯二酚产生醌,后者在525nm有特征光吸收。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:20mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:5mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次); 8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)或果汁样本的处理:
按照血清(浆)或果汁体积(mL):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议取0.1mL血清(浆)或果汁加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
多酚氧化酶(PPO)测试盒测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至525nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在EP管中依次加入下列试剂)
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | |
煮沸的样本【注1】 | 50 | |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂二 | 50 | |
蒸馏水 | 50 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确水浴10min(酶促反应时间)后,95℃水浴5min(终止酶促反应),冷却至室温,10000g,25℃离心10min,收集上清,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,525nm处检测测定管和对照管吸光度,计算ΔA=A测定-A对照。
【注1】每个测定管需要设一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行5min 95℃水浴处理。
PPO活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)或果汁PPO活性
单位的定义:每分钟每mL血清(浆)或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO(U/mL)=ΔA×V反总÷(V液×V样÷V样总)÷0.01÷T=60×ΔA÷V液。
2、组织、细菌或细胞PPO活性
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T=60×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算:
单位定义:每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V样÷V 样总)÷0.01÷T=60×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO(U/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA
V反总:反应体系总体积,0.3mL;V液:加入血清(浆)或果汁体积,0.1mL; V样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)或果汁PPO活性
单位的定义:每分钟每mL血清(浆)或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO(U/mL)=ΔA×V反总÷(V液×V样÷V样总)÷0.005÷T=120×ΔA÷V液
2、组织、细菌或细胞PPO活性
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.005÷T=120×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算:
单位定义:每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T=120×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO(U/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=0.24×ΔA
V 反总:反应体系总体积,0.3mL;V液:加入血清(浆)或果汁体积,0.1mL; V样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。