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多酚氧化酶(PPO)测试盒

简要描述:多酚氧化酶(PPO)测试盒测定意义:主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是一种含铜的氧化酶, 能使一元酚和二元酚氧化产生醌,从而引起褐化,与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理:PPO能够催化邻苯二酚产生醌,后者在525nm有特征光吸收。

  • 产品型号:PPO-2-V
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2023-11-21
  • 访  问  量:565
详情介绍

多酚氧化酶(PPO)测试盒

微量法100管/48样。

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

测定意义:

PPO(EC1.10.3.1)主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是一种含铜的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化产生醌,从而引起褐化,与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

测定原理:

PPO能够催化邻苯二酚产生醌,后者在525nm有特征光吸收。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:20mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:5mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次); 8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)或果汁样本的处理:

按照血清(浆)或果汁体积(mL):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议取0.1mL血清(浆)或果汁加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

多酚氧化酶(PPO)测试盒测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至525nm,蒸馏水调零。

2、样本测定(在EP管中依次加入下列试剂)

试剂名称(μL)

测定管

对照管

样本

50

 

煮沸的样本【注1】

 

50

试剂一

200

200

试剂二

50

 

蒸馏水

 

50

37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确水浴10min(酶促反应时间)后,95℃水浴5min(终止酶促反应),冷却至室温,10000g,25℃离心10min,收集上清,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,525nm处检测测定管和对照管吸光度,计算ΔA=A测定-A对照。

【注1】每个测定管需要设一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行5min 95℃水浴处理。

PPO活性计算:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)或果汁PPO活性

单位的定义:每分钟每mL血清(浆)或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO(U/mL)=ΔA×V反总÷(V液×V样÷V样总)÷0.01÷T=60×ΔA÷V液。

2、组织、细菌或细胞PPO活性

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位定义:每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T=60×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算:

单位定义:每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V样÷V 样总)÷0.01÷T=60×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO(U/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.3mL;V液:加入血清(浆)或果汁体积,0.1mL; V样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)或果汁PPO活性

单位的定义:每分钟每mL血清(浆)或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。

PPO(U/mL)=ΔA×V反总÷(V液×V样÷V样总)÷0.005÷T=120×ΔA÷V液

2、组织、细菌或细胞PPO活性

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位定义:每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。

PPO(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.005÷T=120×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算:

单位定义:每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。

PPO(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T=120×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。

PPO(U/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=0.24×ΔA

V 反总:反应体系总体积,0.3mL;V液:加入血清(浆)或果汁体积,0.1mL; V样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

 

 

 

 

 

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