过氧化氢酶（CAT）测试盒（钼酸铵比色法）                    

       分光光度法50管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：                          

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理：

H2O2在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

工作液：60mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

过氧化氢酶（CAT）测试盒（钼酸铵比色法）

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm处，蒸馏水调零。

2、测定前将CAT检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min。

3、在1mL石英比色皿中加入35μL样本和1mL工作液，混匀，室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2

注意事项：

出现负值怎么办？

检查反应过程是否产生气泡，气泡多说明酶活性太高，气泡影响产生了负值，可以将样本用提取液稀释10倍后再检测。如果稀释样本或反应体系没有产生气泡仍然出现较小的负值，说明该样本测不到该酶活。

CAT活性计算：

1、血清（浆）CAT活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=678×ΔA

2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=678×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min /104 cell)＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T =1.356×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.035×10-3 L；ε：H2O2摩尔消光系数，4.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.035 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万。